Método de Coloración Rápida: Hematoxilina y Eosina (H&E) para Cortes por Congelación

• Criostato: Para obtener el corte.
• Portaobjetos: Preferiblemente cargados positivamente (adherentes) para evitar que el tejido se desprenda.
• Fijador de elección: Alcohol Isopropílico al 95% o 100%. Es rápido y evita la formación de cristales de hielo (artefacto) mejor que el formol en este contexto.
• Hematoxilina: Una de progresión rápida (ej: Harris, Gill). Debe estar filtrada diariamente.
• Eosina: Solución acuosa o alcohólica.
• Baños de Alcohol: Para la deshidratación (Alcohol 95% y 100%).
• Baños de Xileno: Para el aclarado.
• Medio de Montaje: Resina sintética (ej: Entellan, DPX).
• Cronómetro o Temporizador.

• Velocidad vs. Calidad: Se prioriza la velocidad para el cirujano. Es normal que la calidad no sea tan perfecta como en un bloque de parafina.
• Calidad del Congelado: Un buen corte es la base. Si el tejido está mal congelado (cristales de hielo), la tinción será pobre.
• Espesor del Corte: Los cortes son más gruesos (5-10 µm), lo que puede dar una apariencia menos nítida.
• Control de Reactivos: Verificar siempre los reactivos. Una hematoxilina vieja dará un resultado pálido.

El propósito del "azuleo" es elevar el pH del tejido para que la hematoxilina (que es rojiza/marrón en medio ácido) se transforme en su color azul púrpura característico, lo que proporciona un máximo contraste nuclear.

Si no tiene agua amoniacal ni carbonato de litio, aquí están sus opciones, ordenadas por eficacia:

Opción 1: Sustitutos Directos (Los más recomendables)

Agua del grifo ligeramente alcalina (La alternativa más común):

• Procedimiento: Deje correr el agua del grifo sobre el portaobjetos por 30-60 segundos.
• Fundamento: El agua de la red de suministro suele tener un pH ligeramente básico (7.5 - 8.5) debido a los tratamientos de potabilización. Este pH es suficiente para lograr un "azuleo" aceptable, aunque será más lento.
• Consejo: Si el agua de su zona es muy blanda o ácida, esta opción no funcionará bien.

Solución de Bicarbonato de Sodio:

• Preparación: Añada una pizca (aproximadamente 0.5 gramos) de bicarbonato de sodio (de cocina) a 250-500 ml de agua destilada o del grifo. Agite suavemente.
• Procedimiento: Sumerja el portaobjetos en esta solución o haga un lavado directo durante 20-30 segundos.
• Fundamento: El bicarbonato de sodio (NaHCO₃) crea una solución ligeramente alcalina (pH ~8.3), perfecta para el azuleo.
• Precaución: No hacer la solución demasiado concentrada, ya que puede dañar el tejido o precipitar.

Opción 2: Modificación del Protocolo (Eliminando el paso de "Azuleo")

Si no tiene nada para alcalinizar, puede modificar la secuencia. La calidad no será óptima, pero el diagnóstico suele ser posible.

Protocolo Modificado Rápido (Sin Azuleo):

1. Fijación: Alcohol Isopropílico 95-100% - 30 segundos.
2. Lavado en Agua: Enjuague RÁPIDO (2-3 segundos) para quitar el exceso de alcohol.
3. Hematoxilina: Tiempo reducido a 10-15 segundos. Con menos tiempo, el núcleo se tiñe pero no se sobrecarga tanto de colorante ácido, por lo que el cambio de color es menos crítico.
4. "Lavado Azulador" Prolongado: Enjuague con agua corriente el mayor tiempo que pueda permitirse (45-60 segundos). Este lavado prolongado ayuda a eliminar el exceso de hematoxilina y, con el pH del agua, proporciona un azuleo muy tenue pero a menudo suficiente.
5. Eosina: 5-10 segundos. Como los núcleos estarán menos azules y más rojizos, use menos tiempo de eosina para evitar un contraste excesivo de rojo sobre rojo.
6. Continúe con la deshidratación y el montaje como es habitual.

Resultado Esperado: Los núcleos se verán de un color azul grisáceo o púrpura apagado. El contraste será menor, pero un patólogo experimentado podrá distinguir las estructuras celulares.

Opción 3: Soluciones de Emergencia (Menos Ideales, pero Funcionales)

• Jabón Diluido: Una gota de jabón líquido neutro para manos en un vaso de agua. El pH será básico. Enjuague muy bien después para evitar manchas.
• Saliva (Último recurso): La saliva tiene un pH ligeramente alcalino. Es una opción teórica y antihigiénica, no recomendable en un laboratorio.

Conclusión y Recomendación Profesional

Mi recomendación prioritaria es la Opción 1B: Solución de Bicarbonato de Sodio. Es fácil, barata y efectiva. Si no es posible, la Opción 2 (Modificación del Protocolo) es una alternativa viable. Recuerde: en la tinción por congelación, la fijación rápida y correcta con alcohol es aún más crítica que el azuleo para preservar la morfología celular.

Para una evaluación muy rápida (ej. confirmar presencia de tejido), se puede usar:

• Azul de Toluidina: Una inmersión y lavado rápido tiñe núcleos y cartílago.
• Rojo Sudan o Oil Red O: Específicos para teñir lípidos (grasa) en rojo/anaranjado.

Estos productos se conocen como "sustitutos seguros del xileno" o "aclarantes no tóxicos". Son menos volátiles y menos peligrosos para la salud.

Opción 1: Sustitutos Comerciales Directos (Los más recomendables)

Son los que debe intentar conseguir a medio plazo. Suelen estar basados en disolventes de aceites vegetales (limoneno) o hidrocarburos alifáticos.

• Ejemplos: Histo-Clear®, SafeClear®, CitriSolv®, Sub-X®.
• Procedimiento: Se usan exactamente igual que el xileno. Dos baños de 1-2 minutos cada uno.
• Ventaja: Son mucho menos tóxicos que el xileno y no emiten vapores peligrosos.
• Desventaja: Pueden ser más costosos y, en algunos casos, dejar un olor cítrico residual.

Opción 2: Tolueno o Benceno (Alternativas Químicas Clásicas)

• Procedimiento: Idéntico al del xileno.
• Advertencia CRUCIAL: NO SE RECOMIENDAN. El benceno es carcinógeno reconocido. El tolueno es menos tóxico que el xileno pero aún así es un peligro para la salud por inhalación y absorción cutánea. Solo deben usarse en campanas de extracción de gases.

Opción 3: Modificación del Protocolo (Para Emergencias sin ningún Aclarante)

Si no tiene acceso a NINGÚN aclarante, puede intentar esta modificación. La calidad se verá afectada, pero la lámina puede ser diagnosticable.

Protocolo de Emergencia: "Montaje Húmedo" o "Montaje Directo desde Alcohol"

Este método evita por completo la necesidad de un aclarante.

1. Siga los pasos normales hasta la Eosina y el primer baño de Alcohol 95%.
2. Deshidratación AGRESIVA: Pase la lámina por TRES baños sucesivos de Alcohol Isopropílico o Etanol al 100% (absoluto) durante 1 minuto cada uno. Es crítico eliminar TODA traza de agua.
3. Montaje con Medio Soluble en Alcohol (Paso Clave): El medio de montaje estándar (DPX, Entellan) no es miscible con alcohol. Necesita un medio de montaje específico soluble en alcohol, como la Glicerina gelatina. Saque la lámina del último baño de alcohol, escurra el exceso, coloque una gota generosa de glicerina gelatina y cubra.

Resumen de Recomendaciones en Orden de Prioridad

• Mejor Opción (Seguridad y Calidad): Adquirir un sustituto comercial del xileno (ej: Histo-Clear, SafeClear).
• Opción para Emergencia (Calidad Aceptable): Usar Tolueno con extrema precaución y en una campana de extracción.
• Opción para Emergencia Extrema (Diagnóstico de Salvamento): Usar el protocolo modificado con deshidratación agresiva en alcohol 100% y montaje con glicerina gelatina.

Consecuencias de no usar un aclarante o sustituto adecuado:

• Lámina Turbia o Lechosa: Debido a la incompatibilidad entre el alcohol y el medio de montaje.
• Mala Resolución Microscópica: La turbidez impide ver los detalles celulares finos.
• Tinción No Permanente: La lámina se secará o se estropeará rápidamente.

En conclusión: Para un trabajo de rutina y de calidad, los sustitutos comerciales del xileno son la mejor opción. En una emergencia absoluta, el protocolo de montaje con glicerina gelatina desde alcohol puede salvar la situación.