PROTOCOLO DE TINCIÓN DE PAPANICOLAOU

(MODIFICADO PARA MENOR USO DE ALCOHOL Y ÁCIDO)

El Pap es una tinción policromática que permite un detallado estudio de la cromatina y la diferenciación citoplasmática (queratinización, metaplasia, etc.).

Principio:

Utiliza múltiples colorantes (hematoxilina, Orange G, EA-50 o EA-65) que se diferencian con alcohol acidificado para obtener una gama de colores.

Modificaciones para eficiencia:

• Volúmenes reducidos: Usar cubetas pequeñas o frascos de boca estrecha para minimizar la evaporación y el volumen de reactivo necesario.
• Alcohol acidificado reutilizable: El alcohol acidificado para la diferenciación puede usarse para varias series de tinciones si se controla su fuerza.
• Baños de alcohol de menor concentración: Se puede utilizar etanol al 95% para la deshidratación inicial y final en lugar de al 100%, reduciendo costos.

Reactivos Necesarios:

• Fijador: Alcohol etílico al 95% (Spray citofijador o en baño).
• Hematoxilina de Papanicolaou (ej. Harris o Gill).
• Alcohol acidificado (0.5% HCl en alcohol al 70% o 95%).
• Solución de Orange G.
• Solución de EA-50 o EA-65 (Eosina Azure).
• Alcohol al 95% (para deshidratación).
• Alcohol absoluto (opcional, se puede sustituir por 95% en la mayoría de pasos).
• Xilol o sustituto de xilol.
• Medio de montaje.

Procedimiento Paso a Paso:

1. Fijación: Las muestras (LBC o convencionales) deben estar fijadas inmediatamente en alcohol etílico al 95% durante un mínimo de 15 minutos. La fijación adecuada es crítica.
2. Hidratación: Sumergir en Alcohol al 70% y luego en Agua destilada (1 min cada uno). Esto prepara las células para la tinción acuosa.
3. Tinción Nuclear: Hematoxilina durante 3-5 minutos.
4. Enjuagar en agua corriente.
5. Diferenciación (Paso Ácido Clave): Sumergir en Alcohol acidificado (0.5% HCl) por 2-5 inmersiones rápidas. Este es el paso más crítico. El exceso de tiempo aquí destruirá la tinción nuclear.
6. Enjuagar exhaustivamente en agua corriente (5-10 minutos).
7. "Azuleo": Sumergir en agua corriente o agua con un poco de bicarbonato/litro (1-2 minutos).
8. Deshidratación: Sumergir en Alcohol al 70% y luego en Alcohol al 95% (1 min cada uno).
9. Tinción Citoplasmática: Orange G durante 1-2 minutos.
10. Enjuagar en 2 baños de Alcohol al 95% (brevemente, para eliminar el exceso).
11. EA-50 o EA-65 durante 2-5 minutos (ajustar según la reactividad del lote).
12. Enjuagar en 2 baños de Alcohol al 95% (brevemente).
13. Deshidratación Final y Aclarado:
14. Sumergir en Alcohol al 95% (2 baños de 1 minuto cada uno). Este paso puede hacerse con alcohol al 95% en lugar de absoluto.
15. Si se requiere mayor claridad, usar un baño de Alcohol absoluto (1 min).
16. Sumergir en Xilol o sustituto (2-3 baños de 2 minutos cada uno).
17. Montaje: Montar con medio de montaje de resina sintética.

Consejo de Eficiencia:

El alcohol acidificado (Paso 4) es donde se gasta más ácido. Prepare volúmenes pequeños y cámbielo cuando note que diferencia demasiado lento (núcleos pálidos) o demasiado rápido (pérdida de núcleos en todas las muestras). El control visual es esencial.