El Pap es una tinción
policromática
que permite un
detallado
estudio
de
la cromatina y
la
diferenciación
citoplasmática
(queratinización,
metaplasia,
etc.).
Principio:
Utiliza
múltiples
colorantes
(hematoxilina,
Orange G, EA-50
o EA-65) que se
diferencian con
alcohol
acidificado para
obtener una gama
de colores.
Modificaciones
para
eficiencia:
- Volúmenes
reducidos: Usar
cubetas pequeñas
o frascos de
boca
estrecha
para minimizar
la evaporación y
el volumen de
reactivo
necesario.
- Alcohol
acidificado
reutilizable: El
alcohol
acidificado para
la
diferenciación
puede usarse
para varias
series de
tinciones si
se
controla su
fuerza.
- Baños de
alcohol de menor
concentración:
Se puede
utilizar
etanol
al
95% para la
deshidratación
inicial y final
en lugar de al
100%,
reduciendo
costos.
Reactivos
Necesarios:
- Fijador:
Alcohol etílico
al 95% (Spray
citofijador o en
baño).
- Hematoxilina
de Papanicolaou
(ej. Harris o
Gill).
- Alcohol
acidificado
(0.5% HCl en
alcohol al 70% o
95%).
- Solución de
Orange G.
- Solución de
EA-50 o EA-65
(Eosina
Azure).
- Alcohol al 95%
(para
deshidratar).
- Alcohol
absoluto
(opcional, se
puede sustituir
por 95% en la
mayoría
de pasos).
- Xilol o
sustituto de
xilol.
- Medio de
montaje.
Procedimiento
Paso a
Paso:
1. Fijación: Las
muestras (LBC o
convencionales)
deben estar
fijadas
inmediatamente
en alcohol
etílico al 95%
durante un
mínimo de 15
minutos. La
fijación
adecuada es
crítica.
2. Hidratación:
Sumergir en
Alcohol al 70% y
luego en Agua
destilada
(1
min cada uno).
Esto prepara las
células para la
tinción
acuosa.
3. Tinción
Nuclear:
Hematoxilina
durante 3-5
minutos.
4. Enjuagar en
agua
corriente.
5.
Diferenciación
(Paso Ácido
Clave): Sumergir
en Alcohol
acidificado
(0.5% HCl) por
2-5 inmersiones
rápidas. Este es
el paso más
crítico.
El
exceso de tiempo
aquí destruirá
la tinción
nuclear.
6. Enjuagar
exhaustivamente
en agua
corriente (5-10
minutos).
7. "Azuleo":
Sumergir en agua
corriente o agua
con un poco de
bicarbonato/litro
(1-2
minutos).
8.
Deshidratación:
Sumergir en
Alcohol al 70% y
luego en Alcohol
al
95%
(1 min cada
uno).
9. Tinción
Citoplasmática:
Orange G durante
1-2 minutos.
10. Enjuagar en
2 baños de
Alcohol al 95%
(brevemente,
para
eliminar
el
exceso).
11. EA-50 o
EA-65 durante
2-5 minutos
(ajustar según
la
reactividad
del
lote).
12. Enjuagar en
2 baños de
Alcohol al 95%
(brevemente).
13.
Deshidratación
Final y
Aclarado:
- Sumergir en
Alcohol al 95%
(2 baños de 1
minuto cada
uno).
Este
paso
puede hacerse
con alcohol al
95% en lugar de
absoluto.
- Si se requiere
mayor claridad,
usar un baño de
Alcohol
absoluto (1
min).
- Sumergir en
Xilol o
sustituto (2-3
baños de 2
minutos cada
uno).
14. Montaje:
Montar con medio
de montaje de
resina
sintética.
Consejo de
Eficiencia:
El
alcohol
acidificado
(Paso
4) es donde se
gasta más ácido.
Prepare
volúmenes
pequeños y
cámbielo
cuando note que
diferencia
demasiado lento
(núcleos
pálidos) o
demasiado
rápido (pérdida
de núcleos en
todas las
muestras). El
control
visual
es
esencial.