Excelencia en Diagnóstico Patológico

Este protocolo es rápido, eficaz y ideal para una evaluación intraoperatoria.

Principio:
La tinción de Hematoxilina-Eosina (H&E) es el estándar de oro. La hematoxilina tiñe los núcleos de azul/púrpura, mientras que la eosina tiñe el citoplasma y las estructuras extracelulares de rosa.

Ventajas de este protocolo:
- Bajo consumo de alcohol: Utiliza solo dos baños de alcohol de 95° (uno para fijar y otro para deshidratar).
- Rápido: Menos de 2 minutos.
- Eficiente: Proporciona un contraste nuclear-citoplasmático excelente.

Reactivos Necesarios:
- Fijador: Alcohol isopropílico o etanol al 95%.
- Hematoxilina Harris (o similar).
- Agua acidificada (1-2 gotas de HCl concentrado en 500 ml de agua destilada).
- Eosina acuosa o alcohólica.
- Alcohol al 95% (para deshidratar).
- Xilol o sustituto de xilol (para aclarar).
- Medio de montaje sintético.

PROCEDIMIENTO PASO A PASO:
1. Fijación Inmediata: Sumergir la impronta inmediatamente después de tomarla en Alcohol al 95% durante 30 segundos. Esto previene el secado al aire y la distorsión celular.
2. Escurrir el exceso de alcohol.
3. Tinción Nuclear (Hematoxilina): Sumergir el portaobjetos en Hematoxilina Harris durante 20-30 segundos.
4. Enjuagar con agua corriente hasta que el agua salga clara (20-30 segundos).
5. Diferenciación: Sumergir brevemente (1-3 inmersiones rápidas) en Agua acidificada. Este paso elimina el exceso de hematoxilina de los citoplasmas. ¡No exceder el tiempo!
6. Enjuagar inmediatamente en agua corriente (10 segundos).
7. "Azuleo": Sumergir en agua con un pH ligeramente alcalino (agua del grifo es suficiente) durante 10 segundos para volver los núcleos de un azul brillante.
8. Tinción Citoplasmática (Eosina): Sumergir en Eosina durante 10-20 segundos.
9. Escurrir el exceso.
10. Deshidratación y Aclarado: Sumergir en Alcohol al 95% (2 baños rápidos de 5-10 segundos cada uno) para deshidratar.
11. Sumergir en Xilol o sustituto de xilol (2 baños de 30 segundos cada uno) para aclarar.
12. Montaje: Montar con medio de montaje sintético y cubrir con un cubreobjetos.

Nota: Para una evaluación ultra-rápida (menos de 60 segundos), muchos tecnólogos utilizan tinciones tipo Diff-Quik (Romanowsky modificado), que son aún más rápidas y usan muy poco alcohol, pero el contraste H&E es más familiar para los patólogos en el contexto intraoperatorio.

El Pap es una tinción policromática que permite un detallado estudio de la cromatina y la diferenciación citoplasmática (queratinización, metaplasia, etc.).

Principio:
Utiliza múltiples colorantes (hematoxilina, Orange G, EA-50 o EA-65) que se diferencian con alcohol acidificado para obtener una gama de colores.

Modificaciones para eficiencia:
- Volúmenes reducidos: Usar cubetas pequeñas o frascos de boca estrecha para minimizar la evaporación y el volumen de reactivo necesario.
- Alcohol acidificado reutilizable: El alcohol acidificado para la diferenciación puede usarse para varias series de tinciones si se controla su fuerza.
- Baños de alcohol de menor concentración: Se puede utilizar etanol al 95% para la deshidratación inicial y final en lugar de al 100%, reduciendo costos.

Reactivos Necesarios:
- Fijador: Alcohol etílico al 95% (Spray citofijador o en baño).
- Hematoxilina de Papanicolaou (ej. Harris o Gill).
- Alcohol acidificado (0.5% HCl en alcohol al 70% o 95%).
- Solución de Orange G.
- Solución de EA-50 o EA-65 (Eosina Azure).
- Alcohol al 95% (para deshidratar).
- Alcohol absoluto (opcional, se puede sustituir por 95% en la mayoría de pasos).
- Xilol o sustituto de xilol.
- Medio de montaje.

Procedimiento Paso a Paso:
1. Fijación: Las muestras (LBC o convencionales) deben estar fijadas inmediatamente en alcohol etílico al 95% durante un mínimo de 15 minutos. La fijación adecuada es crítica.
2. Hidratación: Sumergir en Alcohol al 70% y luego en Agua destilada (1 min cada uno). Esto prepara las células para la tinción acuosa.
3. Tinción Nuclear: Hematoxilina durante 3-5 minutos.
4. Enjuagar en agua corriente.
5. Diferenciación (Paso Ácido Clave): Sumergir en Alcohol acidificado (0.5% HCl) por 2-5 inmersiones rápidas. Este es el paso más crítico. El exceso de tiempo aquí destruirá la tinción nuclear.
6. Enjuagar exhaustivamente en agua corriente (5-10 minutos).
7. "Azuleo": Sumergir en agua corriente o agua con un poco de bicarbonato/litro (1-2 minutos).
8. Deshidratación: Sumergir en Alcohol al 70% y luego en Alcohol al 95% (1 min cada uno).
9. Tinción Citoplasmática: Orange G durante 1-2 minutos.
10. Enjuagar en 2 baños de Alcohol al 95% (brevemente, para eliminar el exceso).
11. EA-50 o EA-65 durante 2-5 minutos (ajustar según la reactividad del lote).
12. Enjuagar en 2 baños de Alcohol al 95% (brevemente). 13. Deshidratación Final y Aclarado:
- Sumergir en Alcohol al 95% (2 baños de 1 minuto cada uno). Este paso puede hacerse con alcohol al 95% en lugar de absoluto.
- Si se requiere mayor claridad, usar un baño de Alcohol absoluto (1 min).
- Sumergir en Xilol o sustituto (2-3 baños de 2 minutos cada uno).
14. Montaje: Montar con medio de montaje de resina sintética.

Consejo de Eficiencia:
El alcohol acidificado (Paso 4) es donde se gasta más ácido. Prepare volúmenes pequeños y cámbielo cuando note que diferencia demasiado lento (núcleos pálidos) o demasiado rápido (pérdida de núcleos en todas las muestras). El control visual es esencial.

Tiempos exactos, contingencias y controles de calidad para obtener láminas diagnósticas óptimas (temperatura ambiente 20-25 °C).

1. Pre-coloración

Paso	Reactivo	Tiempo	Notas críticas
1	Fijación Alcohol-Eter 1:1	30 min (máx 24 h)	Tapar; evita autolisis
2	Hidratación – Agua corriente	2 min	Cambiar si el agua se enturbia

2. Tinción nuclear (Hematoxilina Harris)

Paso	Reactivo	Tiempo	Indicadores / control
3	Hematoxilina Harris	2 min 30 s	Filtrar antes de usar
4	Agua corriente	30 s	Lavado por arrastre
5	Diferenciación HCl 1 %	3-5 s	Fondo apenas claro
6	Agua corriente	30 s	Detener ácido
7	Azulación – Agua amoniacal	30-45 s	Núcleo azul intenso
8	Agua corriente	2 min	Eliminar alcali; secar borde

3. Tinción citoplasmática

Paso	Reactivo	Tiempo	Objetivo / observación
9	Alcohol 96 %	30 s	Pre-deshidratación
10	Orange G	1 min 30 s	Queratina → naranja
11	Alcohol 96 %	30 s	Lavado
12	EA-50	2 min	Citoplasma: rosa/verde/pardo
13	Alcohol 96 %	30 s	Retirar colorante libre
14	Alcohol 96 % (2.º baño)	30 s	Asegura limpieza

4. Deshidratación – Aclaramiento – Montaje

Paso	Reactivo	Tiempo	Indicador
15	Alcohol absoluto I	1 min	Sin turbidez
16	Alcohol absoluto II	1 min	Deshidratación completa
17	Xilol I	1 min	Muestra transparente
18	Xilol II	1 min	Bordes irisados
19	Resina de montaje	Inmediato	Sin burbujas; índice refracción 1,48-1,52